摘要: 目的: 观察鼻炎清颗粒治疗大鼠变应性鼻炎(aR)后鼻粘膜组织形态学变化和细胞因子水平,了解该药治疗aR的部分免疫学机制。方法: 用卵清白蛋白、氢氧化铝、百白破疫苗联合致敏大鼠制成变应性鼻炎动物模型,将鼻炎清颗粒灌胃给药2周后,观察鼻粘膜组织学变化,用ELISa法检测血清中细胞因子IL4、IFNr水平。结果: 鼻炎清颗粒治疗组中大剂量组和中剂量组血清1L4水平明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01～0.05)；IFNr水平明显高于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)；光镜观察发现,模型组鼻粘膜上皮细胞脱落、水肿、血管扩张、腺体增生,固有层内可见大量嗜酸性粒细胞、肥大细胞浸润,用药组中大剂量组和中剂量组及阴性对照组则无上述改变。结论:鼻炎清颗粒通过调节Th1和Th2细胞因子的表达,纠正失衡的Th1/Th2的细胞因子网络并抑制炎症细胞在鼻粘膜的汇集,防止其脱颗粒,对变应性鼻炎产生治疗作用。

关键词： 鼻炎清颗粒；变应性鼻炎；细胞因子；嗜酸性细胞

Regulate effection of Interleukin4，Interferonγ in serum of allergic rhinitis in rat by using rhinitis clean granula

Saltanat， WU Xinhua， XUYan， et al

(Department of Clinical Laboratory, Second affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China)

abstract: Objective: To study the influence of Biyanqing(Rhinitis clean granula, RCG) on serum concentration of cytokine in allergic rhinitis model and the morphologic changes. Methods: Establish allergic rhinitis model of rat by injecting vaccine (OVa+alumina+polyvalent vaccine). after that rats were with filled stomach RCG. Two weeks later the levels of serum cytokines IL4, IFNγwere determined by ELISa , and observe the changes of nose mucosa by light microscope. Results: after the treatment by using RCG, the levels of Serum IL4 in both highdosage and middledosage therapy groups were lower than that in mode group that arkedly (P<0.01 and P<0.05). The levels of serum IFNγin both highdosage and middledosage therapy groups were higher than that in model group markedly (P<0.01)； Under light microscope， we obserred that the morphology of nose mucosa in allergic rhinitis model was changed, break off of epithelia,dropsy,dilation of blood vessel,hyperplasia of gland,there were a lot of eosinophils and mast cells infiltration, In blank contrast group and therapy groups highdosage and middledosage,there were no eosinophils and mast cells filtration. Conclusion: The RCG is highly effective in treating allergic rhinitis by regulating the expression of Th1 and Th2 cytokines and correcting the imbalance Th1/Th2 cytokines network， restaining the assembl of inflammatory cells in nose mucosa in allergic rhinitis rat stabilize the membrane of cells and preventing degranulation.

Key words: biyanqing (rhinitis clear grahula); allergic rhinitis; cytokines; eosinocyte

目前研究认为变应性鼻炎(allergic rhinitis, aR)是一系列细胞间相互作用的结果,开始于抗原呈递细胞(antigen presenting cell, aPC)对变应原的摄取和加工处理,而后将变应原传给Th细胞,Th细胞的分化产生偏移,Th1/Th2失衡,成为Th2>Th1反应,Th2细胞诱导B细胞分泌IgE。当相同的变应原再次进入时,与IgE结合,使肥大细胞脱颗粒释放组胺、前列腺素和白三烯等炎性介质,引起毛细血管扩张、通透性增加、腺体分泌增加、嗜酸性粒细胞浸润等,由此引起aR的临床症状［1］。本研究通过aR大鼠模型探讨纯中药制剂鼻炎清颗粒对血清Th1/Th2细胞因子水平的影响及大鼠鼻粘膜组织形态学变化,为临床用药提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物分组及给药方法健康Wistar大鼠70只(由新疆医科大学实验动物中心提供),均为雄性,体重150～220 g,随机分为7组(每组10只)：(1) 阴性正常对照组(a组):每只大鼠每天给予生理盐水2 ml。(2)阳性aR模型组(B组):每只大鼠每天给予生理盐水2 ml。(3)辛芩颗粒对照治疗组(C组):每只每天给予辛芩颗粒39.1 mg/100 g，灌胃给药14 d后处死。(4)地塞米松对照治疗组(D组):每只每天给予地塞米松0.054 mg/100 g，灌胃给药7 d后处死。(5)鼻炎清颗粒大剂量治疗组(E组):每只每天给予鼻炎清颗粒328 mg/100 g，灌胃给药14 d后处死。(6)鼻炎清颗粒中剂量治疗组(F组):每只每天给予鼻炎清颗粒164 mg/100 g，灌胃给药14 d后处死。(7)鼻炎清颗粒治小剂量疗组(G组):每只每天给予鼻炎清颗粒82 mg/100 g，灌胃给药14 d后处死。除了a组外,以上各组大鼠每天灌胃后1 h,用1 g/L卵白蛋白生理盐水滴鼻,每侧10 μl，观察半小时,了解动物变应性鼻炎发作情况。

1.2主要试剂卵清白蛋白(上海伯奥生物科技有限公司,批号20040902),氢氧化铝(北京化学试剂工厂产品),白百破疫苗(成都生物制品研究所),生理盐水（新疆医科大学第二附属医院制剂中心）,鼻炎清颗粒(由新疆医科大学中医学院、中医研究所监制),IL4及IFNr酶联免疫吸附测定(ELISa)试剂盒购于晶美公司(批号20041220)。

1.3动物模型建立全身致敏:乙醚麻醉大鼠,在大鼠左右前肢和后肢部分别注射0.1 ml和0.2 ml的抗原佐剂混悬液(1 ml盐水+白蛋白5 mg+百白破疫苗2 ml+aL(OH)10 mg),进行初次致敏。初次致敏5 d后,进行强化致敏，将5 mg卵清白蛋白溶解于1 ml生理盐水注入大鼠背部0.3 ml。局部抗原攻击:初次致敏的第7天开始每天1次用卵清白蛋白1 g/L滴鼻,每次20 μl,连续7 d,第8天(滴鼻的第8天,初次致敏的第15天)开始灌胃给药,每天灌药后1 h滴鼻白蛋白1 g/L,20 μl/只,直到处死为止,每隔7 d观察1次白蛋白生理盐水溶液1 g/L攻击双侧鼻腔20 μl滴鼻后大鼠打喷嚏及搔鼻的次数,观察时间均为30 min。阴性正常对照组用生理盐水代替抗原佐剂混悬液,方法同实验组。

1.4动物模型行为学观察每次鼻腔致敏后,观察30 min。记录大鼠鼻清涕量、喷嚏及搔鼻次数,采用叠加法计算总分,总分超5分为模型成功。鼻痒:无抓鼻为0分,轻度抓鼻为1分,频繁抓鼻(每分钟10~20次)为2分,抓鼻不止为3分；喷嚏:无喷嚏为0分,打喷嚏1~3个为1分,4~10个为2分,>11个为3分；鼻涕:无鼻涕为0分,流至前鼻孔为1分,超出前鼻孔为2分,鼻涕流满为3分。

1.5标本采集治疗完毕的当天灌胃给药,滴鼻后2 h用乙醚麻醉大鼠,切开腹部暴露腹部主动脉采集全血8 ml,置于3 000 r/min的离心机离心获得血清,分别置于Enppendorf管中,置-70℃冰箱备以后ELISa检查用。剥去大鼠上颌骨部皮肤,将上颌骨从颅骨中游离,取鼻中隔粘膜,放入10%甲醛溶液固定,然后石蜡包埋鼻中隔粘膜,常规切片行HE染色,光镜下观察组织学改变。同时每组部分鼻粘膜切片用瑞氏姬姆萨染色法,在油镜下按一定的方向顺序对所见到的每一个白细胞进行分类,既不重复亦不遗漏,共计数200个白细胞,以分类计数法计数嗜酸性粒细胞(EOS)。

1.6细胞因子的测定采用ELISa法分别检测大鼠血清IL4及IFNr水平,具体操作方法严格按使用说明书进行,于酶标仪450 nm处读吸光度值,根据标准曲线计算1L4及IFNr浓度值。

1.7统计学处理在SPSS 12.0建库并进行统计学分析,计量资料采用方差分析,数据以(±s)表示,当P<0.05时,进一步作任一两均数间的比怎样治疗鼻炎清颗粒对大鼠变应性鼻炎1L4、IFNr水平的调节的能力是免疫现象的基础。机体的免疫系统还可对不同类型的异体物质作出不同的应答反应。一个有效的免疫系统是机体维持自身稳定，抵御外源性和内源性异体的重要因素，没有这种保护功能，机体将难以生存。但是，免疫反应也会带来对机体不利的影响，如鼻粘膜免疫反应过强，又可导致一系列临床过程，危害身体健康，这就是过敏性鼻炎。现在您对“过敏性鼻炎具有免疫系统吗”这一问题有所认识了吧，如果您还有什么不明白的，甚至想要了解更多关于“过敏性鼻炎”的相关知识，您可以温馨提示：医院属国家医保定点单位，凡参保人员，持卡就医实时结算，无需定点选择，均可报销。咨询电话：网站信息仅供参考，不能作为诊断及医疗的依据，就医请遵照医生诊断较,等级资料采用R×C表资料的χ2检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1鼻粘膜组织病理学改变B组可见鼻粘膜组织水肿,血管充血扩张,腺体增生,固有层内可见大量嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润；a组未见过敏炎性反应；E组鼻粘膜的急性过敏性炎症明显改善,间质血管轻度扩张,未见嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润；F组鼻粘膜呈轻度炎症,间质血管轻度扩张,嗜酸性粒细胞和肥大细胞明显减少；G组鼻粘膜的急性过敏炎症未见明显改善,腺体轻度增生,间质血管扩张充血，较多量的嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润；C组鼻粘膜呈炎症及水肿,间质血管扩张充血,少量的嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润；D组鼻粘膜组织呈轻度炎症，间质血管轻度扩张,未见嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润。组织病理学显示,与D组比较,E组治疗后炎性细胞明显减少,粘膜结构恢复正常；F组与C组疗效基本上相同，对过敏性炎症细胞不能完全消除。

2.2鼻炎清颗粒对鼻粘膜嗜酸性粒细胞的影响a组大鼠鼻粘膜组织切片可见极少量的EOS浸润,B组大鼠鼻粘膜组织切片可见大量的EOS浸润,差异有统计学意义(P<0.001),B组与D组、E组比较,差异有统计学意义(P<0.001)；B组与C组、F组比较亦差异有统计学意义(P<0.01)；F组与D组比较差异有统计学意义(P<0.01)；E组与C组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1鼻炎清颗粒对鼻粘膜EOS的影响（略）

表2鼻炎清颗粒对IL4、INFr水平的影响(略)

3讨论

近年的基础研究证实,变应性鼻炎的发病与CD4+T辅助细胞(Th)向Th2偏移,释放大量Th2型细胞因子有关,因此如何控制Th2反应的发生是预防和治疗aR的一个研究热点。CD4+Th细胞根据其分泌细胞因子的种类,而分为不同的细胞亚群,Th0细胞是Th1和Th2细胞的前体细胞。Th1细胞主要分泌IL2、IFNr、TNFβ等细胞因子,主要参与细胞免疫反应，Th1细胞所介导的免疫反应,在抗感染免疫、器官抑制排斥反应和自身免疫病的诱发过程中有重要调节作用。Th2细胞分泌IL13、IL4、IL10、IL3、IL5、IL6等细胞因子,主要参与体液免疫反应,其功能主要是促进B细胞活化,合成IgG1和IgE抗体，Th2细胞在诱发过敏反应中发挥重要的作用。正常情况下,Th1和Th2类细胞因子可相互调节,相互介导,相互抑制,使Th1/Th2处于平衡状态,当二者之间的比例失衡时往往会引起多种疾病的发生,如变应性鼻炎、哮喘、多发性硬化、I型糖尿病等［2］。Th2细胞优势分化和Th2细胞因子IL4、IL5、IL13等过度表达在aR发病机制中起重要作用。IL4和IFNr分别是Th2和Th1反应代表性细胞因子,常作为监测Th反应的检测指标。Th1/Th2细胞因子网络平衡的失调,尤其是Th2细胞因子异常高度表达是aR发生、发展的分子生物学基础之一［3］。Th2型细胞因子IL4促进T0细胞分化为Th2细胞,IL4和IL13协同促使B细胞转变为浆细胞合成IgE［4］。Th1型细胞因子IFNr能抑制B细胞合成IgE和抑制Th0细胞分化Th2型细胞［4］。IL5能诱导人EOS活化、增殖、分化；抑制EOS凋亡,延长其存活时间,提高sICaM1水平和协同IL4促进IgE的分泌作用［5］。张宗芬等［6］对aR患者的鼻分泌物和血清进行IL4和IFNr检测,结果为实验组与对照组血清IL4分别为(78.3±19.1)pg/ml和(38.3±6.9) pg/ml；IFNr则分别为(44.2±23.4)pg/ml和(72.3±38.1)pg/ml,表明aR的发病与IL4水平增高和IFNr水平降低有关。EOS是变态反应主要效应细胞,EOS的减少可减轻炎症反应，抑制EOS脱颗粒,可减轻组织、细胞的反应,改善和修复细胞结构和形态,稳定细胞膜,减少变态反应性疾病的发生［7］。鼻粘膜组织中EOS浸润及数量的增加是变应性鼻炎的一个重要的特征,局部组织损伤、炎症扩散被认为是Th2细胞、抗原呈递细胞、EOS之间的相互作用引起的,这一过程中EOS由几种介质激活并移向炎症区释放活性物质引起组织损伤［8］,因此通过了解EOS被抑制情况来解释该药部分作用机制本研究结果表明。阳性模型组鼻粘膜组织中EOS数量明显高于阴性对照组,鼻粘膜下组织间质水肿、小血管扩张、血管内及组织中EOS浸润明显,固有层内有腺体大量增生。鼻炎清颗粒大剂量治疗组上述病理学改变有明显改善,中剂量治疗组有所减轻,小剂量组几乎无改善,此结果与王玉明等［9］、黄庆山等［10］的报道一致。本研究结果还表明阳性模型组血清Th1细胞因子IFNr水平明显低于阴性正常组,而Th2细胞因子IL4明显高于阴性正常对照组,说明模型建立成功。鼻炎清颗粒大剂量和中剂量具有对IL4水平产生不同程度的抑制作用；而对IFNr产生促进作用；鼻炎清颗粒小剂量对IL4及IFNr的调节作用差；鼻炎清颗粒大剂量与地塞米松比照,两者对IL4及IFNr水平的调节作用基本一致；鼻炎清颗粒中剂量对IL4及IFNr水平的调节作用比地塞米松差；激素治疗aR结果与Wright等［11］报道在体内研究的结果相符,激素可以减少Th2型细胞因子的表达,使CD4+Th细胞从Th2型向Th1型转化,揭示了激素减轻鼻粘膜变应性炎症的机制。鼻炎清颗粒大剂量组及中剂量组与辛苓颗粒对照组比较,表明这两种药对IL4调节作用大致是一致的，而对IFNr水平上调程度有所不同；鼻炎清颗粒大剂量对IFNr水平上调的作用比辛芩颗粒好，而鼻炎清颗粒中剂量对IFNr上调的作用比辛芩颗粒差；鼻炎清颗粒大剂量和中剂量对这些细胞因子的调节结果与章诗富等［12］和卢国化等［13］人的报道一致。张宗芬等［14］追踪观察3年aR患者特异性免疫治疗前后血清和鼻灌洗液中IL4及IFNr的检测结果比较分析后提示，免疫治疗可能通过改善机体的免疫功能发挥作用,也可通过检测血清及鼻灌洗液中IL4及IFNr的水平来监控病情变化和疗效。本组研究结果表明，鼻炎清颗粒的大剂量和中剂量能使实验性aR大鼠血清IL4水平下调,IFNr水平上调,使体内Th细胞分化偏移发生逆转,纠正了失衡的Th1/Th2细胞因子网络,促进Th1/Th2分泌的细胞因子比值恢复平衡,抑制嗜酸性粒细胞活化、增殖、分化,减少IgE的合成,从而有效的抑制炎症细胞在变应性鼻炎大鼠鼻粘膜的汇集,稳定了细胞膜,防止其脱颗粒,减少组织水肿进而达到对aR的治疗作用,该药具有明显抑制或消除aR临床症状的作用,是治疗aR有效的中药之一，需今后对该中药治疗变应性鼻炎的有效成分进行进一步的研究。

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